产品货号：
BTN16-15911
中文名称：
甲型流感(禽流感)病毒H1N1亚型RT-LAMP检测试剂盒
英文名称：
Influenza Virus A Fluorescent and Colorimetric RT-LAMP Kit
产品规格：
50次
发货周期：
1～3天
产品价格：
询价
本公司开发了基于环介导等温扩增(RT-LAMP)的产品，专门用于检测甲型流感(禽流感)病毒H1N1亚型。
甲型H1N1流感为急性呼吸道传染病，在人群中传播。人群对甲型H1N1流感病毒普遍易感，并可以人传染人，人感染甲流后的早期症状与普通流感相似，包括发热、咳嗽、喉痛、身体疼痛、头痛、发冷和疲劳等，有些还会出现腹泻或呕吐、肌肉痛或疲倦、眼睛发红等。
保存：-20℃，有效期一年。阳性对照最好单独放置，不要污染其他试剂。
如果使用水浴锅或金属浴，需要在实验启动前打开并调到65℃。如果用金属浴，还必须在孔中加水以填充金属孔和反应管间的空隙。金属浴和水浴温控远远不如PCR仪器，所以使用前需要用阳性对照和阴性对照(水)做预实验确认可用。
一、样品RNA的制备
二、荧光及可视化RT-LAMP扩增及检测(20μL体系)
三、结果分析及解读
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甲型H1N1流感为急性呼吸道传染病，在人群中传播。人群对甲型H1N1流感病毒普遍易感，并可以人传染人，人感染甲流后的早期症状与普通流感相似，包括发热、咳嗽、喉痛、身体疼痛、头痛、发冷和疲劳等，有些还会出现腹泻或呕吐、肌肉痛或疲倦、眼睛发红等。
- 一般60分钟内出结果，比RT-PCR快约1小时。
- 优化的反应体系。对20μL的反应体系，最大样品加样量可达14μL。
- 含可见光和荧光染料，既可以用金属浴和水浴扩增用可见光肉眼判断结果，也可用荧光PCR仪进行实时荧光检测，还可以金属浴扩增，qPCR进行终点荧光读数。
- 内含的dUTP-UNG可防交叉污染。
- 引物经过精心设计，假阳性率低。
- 灵敏性可达1000拷贝/反应。
- 本产品既可用于RT-LAMP扩增及检测，也可用于LAMP扩增及检测。
- 本产品足够50次20μL体系的RT-LAMP或LAMP扩增反应。
- 只可用于科研，只可进行定性检测，不能用于定量检测。
| 组分 | 规格 |
| 5×荧光及可视化RT-LAMP MagicMix | 200μL |
| Bst DNA聚合酶2.0(8U/μL) | 50μL |
| 20×甲型流感(禽流感)病毒H1N1亚型RT-LAMP引物混合液 | 50μL |
| 甲型流感(禽流感)病毒H1N1亚型RT-LAMP阳性对照(1×103拷贝/μL) | 150μL |
| 超纯水 | 1mL |
保存：-20℃，有效期一年。阳性对照最好单独放置，不要污染其他试剂。
如果使用水浴锅或金属浴，需要在实验启动前打开并调到65℃。如果用金属浴，还必须在孔中加水以填充金属孔和反应管间的空隙。金属浴和水浴温控远远不如PCR仪器，所以使用前需要用阳性对照和阴性对照(水)做预实验确认可用。
一、样品RNA的制备
- 用自选方法纯化样品的RNA，本试剂盒跟市场上大多数病毒RNA提取试剂盒兼容。也可以选购本公司的柱式病毒RNA提取试剂盒。其使用手册可从本公司网站www.bjbalb.com通过搜索产品名称或产品货号BTN71001下载。
- 如果有N个样品，则至少需要做N+2个样品制备，包括一个制备阳性对照(制备时加入自备的跟要检测的靶分子相同的阳性对照模板，一起经历提取过程)和一个制备阴性对照(用水替代样品)。最后N+2个样品一起进行RNA提取操作，得到N+2个RNA样品。
二、荧光及可视化RT-LAMP扩增及检测(20μL体系)
- 反应设置：如果有N+2个RNA样品，则最好设置N+4个RT-LAMP扩增，增加RT-LAMP阴性对照和RT-LAMP阳性对照各1个。在N+4个0.2mLPCR管中加入下列成分：
成分 N+2个
样品管RT-LAMP
阴性对照RT-LAMP
阳性对照5×荧光及可视化RT-LAMP MagicMix 各4μL 4μL 4μL 20×甲型流感(禽流感)病毒H1N1亚型RT-LAMP引物混合液 各1μL 1μL 1μL N+2个样品cDNA 各14μL - - Bst DNA聚合酶2.0 各1μL 1μL 各1μL 超纯水 - 14μL - 试剂盒提供的阳性对照 - - 14μL - 混匀后进行扩增。由于本产品含双染料，可以根据实验室条件选择下列三种方式进行扩增和检测。
- 如果使用PCR仪、金属浴或水浴进行扩增，肉眼检测，则必须先在每个反应管中加30μL自备的石蜡油，否则保温期间反应体系的水分会蒸发，影响反应效率(如果使用PCR仪器并开启热盖，则可以不加石蜡油)。63℃保温90分钟，肉眼观察管内液体颜色。
- 如果使用荧光定量PCR仪：设为63℃保温1分钟/循环，90个循环，每分钟在FAM通道采集一次荧光信号。
- 如果使用PCR仪、金属浴或水浴进行扩增，再使用qPCR仪进行终点法荧光读数：则在扩增前和扩增后，分别在qPCR仪器上测荧光读数(温度设为63℃，1次循环，每次循环1分钟，在FAM通道采集一次荧光信号。
注意：测荧光读数必须在63℃进行)。扩增反应按63℃ 90分钟进行。
三、结果分析及解读
- 如果是用普通PCR仪器、水浴或金属浴进行的扩增，反应结束后只能肉眼判断结果。将反应管放置在白色背景(如白纸)前观察。扩增阳性对照管内反应液将呈现蓝色，无模板和无引物的阴性对照将呈浅蓝色。如果扩增阳性对照管内反应液不呈现蓝色，或无模板和无引物的阴性对照任何一个呈现蓝色，则说明试剂有问题，实验无效。请跟厂家联系。
- 如果实验有效，则分析N+2个样品管的结果。如果样品管反应液的颜色接近扩增阳性对照管则说明有扩增，如果接近无模板和无引物的阴性对照，则说明无扩增。反应结果示例见下图(9为阴性，10为阳性)。
- 如果是用荧光PCR仪进行扩增，则可分析扩增曲线和Ct。试剂盒提供的阳性对照的Ct将小于65，如果大于65，说明试剂可能失效，需跟厂家联系。无模板阴性对照和无引物阴性对照的Ct将大于90。如果任何小于90，则说明试剂或环境被污染，需重复实验或跟厂家联系。如果阳性对照和阴性对照Ct都在正常范围，则分析样品的Ct。Ct小于65的判断为阳性，大于90判为阴性，在65～90之间则需要重复检测。
- 如果使用PCR仪、金属浴或水浴进行扩增，肉眼检测，再使用荧光定量PCR仪进行终点法荧光读数来判断阴阳性，则先比较阳性对照和阴性对照。阳性对照样品扩增后信号增幅应该超过100%，阴性对照扩增后信号增幅应该低于50%，否则实验无效，请与厂家联系。如果两个对照均有效，则比较样品扩增前后荧光读数的差值。如果扩增后荧光信号增幅低于50%，则判断为阴性。如果荧光信号增幅高于100%，则判断为阳性。荧光信号增幅在50～100%之间的，则需要重测。
- 当实时荧光检测和可视化检测同时用于判读结果时，如果彼此不一致，以实时荧光LAMP的数据为准。一般可视化结果滞后实时荧光检测结果20～30分钟，也就是说，在qPCR仪上第30分钟时呈现阳性的样品，其反应液的颜色变化一般在第50～60分钟时才能观察到。
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